RT-PCR Kit（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）
產(chǎn)品說(shuō)明
RT-PCR Kit(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）是專為兩步法RT-PCR第一步實(shí)驗(yàn)配制的、具有高靈敏度的RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)合理配備了與cDNA第一鏈合成反應(yīng)相關(guān)的各種組分，優(yōu)化的體系保證了M-MLV具有高效的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，所得cDNA對(duì)后續(xù)的PCR或定量PCR實(shí)驗(yàn)兼容性好，可用于檢測(cè)稀有基因的表達(dá)、從極少數(shù)細(xì)胞中定量檢測(cè)特定mRNA的表達(dá)水平、克隆特定基因的cDNA片段等。
M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個(gè)71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶?？梢源呋訰NA或DNA：RNA雜交鏈為模板的互補(bǔ)DNA?的聚合反應(yīng)。本酶經(jīng)修飾RNase H活性比普通的逆轉(zhuǎn)錄酶要弱很多，因此在合成第一鏈cDNA的過(guò)程中，可保證RNA的降解程度較低，從而使得率提高。
產(chǎn)品組分
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貨號(hào) |
R1011（20次） |
R1012（100次） |
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M-MLV（200U/μl） |
20 μl |
100 μl |
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RNasin（40U/μl） |
12 μl |
60 μl |
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Oligo d(T)15?Primer（50 μM） |
20 μl |
100 μl |
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Random primer（50 μM） |
20 μl |
100 μl |
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5xfirst-strand buffer |
80 μl |
400 μl |
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RNase-free ddH2O |
1 ml |
1 ml×5 |
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dNTPs(10mM each) |
50 μl |
250 μl |
R1011可進(jìn)行20次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),R1012可進(jìn)行100次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20 μl?標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，每次使用?M-MLV 1μl）。
M-MLV?儲(chǔ)存液
20 mM Tris-HCl (pH 7.5)
200 mM NaCl
0.1 mM EDTA
1 mM DTT
0.01% NP-40
50% glycerol
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5xfirst-strand buffer?成分
250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)
375 mM KCl
15 mM MgCl2
50 mM DTT
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質(zhì)量檢測(cè)
逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)
使用[32P]dCTP作為標(biāo)記，200 U的?M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA為模板進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最低可得到120ng的cDNA，所得cDNA長(zhǎng)度?>?全長(zhǎng)的90%。
核酸外切酶活性檢測(cè)
混合50ng的標(biāo)記DNA?或RNA與200U M-MLV在1×反應(yīng)緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，檢測(cè)DNA和RNA降解都不到總量的1%。
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適用范圍
第一鏈cDNA?合成
cDNA文庫(kù)構(gòu)建
RT-PCR
引物延伸
3'和5' RACE
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注意事項(xiàng)
l??成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)的完整性并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或?SDS。用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡可能用DEPC進(jìn)行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時(shí)，首先用經(jīng)過(guò)滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌處理。
l??為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存?RNA?的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同時(shí)加入4倍體積的乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離心5 min。
l??在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑（RNasin）以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。在第一鏈合成反應(yīng)中，RNase抑制劑在緩沖液和還原劑（如?DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過(guò)程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C?對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了RNase抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。
l??較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開(kāi)，增加反應(yīng)的產(chǎn)量。
l??使用簡(jiǎn)單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應(yīng)的RNA，但為了保證實(shí)驗(yàn)的成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制備的高純度RNA。
l??為防止RNA降解，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，最好保存于-70℃。
l??最佳的PCR反應(yīng)條件，因PCR擴(kuò)增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應(yīng)，以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。
l??cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存。
l??當(dāng)以cDNA為模板進(jìn)行PCR之前，使用RNase H處理cDNA，可以提高PCR反應(yīng)的靈敏度。
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操作步驟
1?在冰浴的無(wú)菌離心管中配制下列混合物
1-5μg RNA
1μl Oligo(dT)15?或Random primer，
補(bǔ)RNase-free ddH2O至13.4μl；
2進(jìn)行變性退火反應(yīng)
70℃溫浴5 min,
簡(jiǎn)短離心后冰浴5 min；
3在上述離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
4 μl? 5×first-strand buffer
1 μl? dNTPs（10 mM each）
0.6μl ?RNasin ,
1 μl? ?M-MLV；
4按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
Oligo (dT)15?：42℃溫浴60 min；
Random primer：?37℃溫浴60 min。
5終止反應(yīng)
70℃溫浴5 min終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。
6用RNase-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到50μl，取2-5μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。