Pfu Mix
Cat. #：P2021，P2022
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Pfu Mix是2×濃縮的PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液，含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴(kuò)增必需組分（模板與引物除外）。使用時(shí)，僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行PCR，大大簡(jiǎn)化操作過程，縮短操作時(shí)間，降低污染（加樣次數(shù)減少）。同時(shí)，由于體系內(nèi)含有優(yōu)化劑與增強(qiáng)劑，能夠顯著增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的靈敏度。擴(kuò)增產(chǎn)物具有平末端。
Pfu DNA聚合酶是極端嗜熱性細(xì)菌Pyrococcus furiosus來源的高度熱穩(wěn)定DNA聚合酶，分子量為90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度可達(dá)5?kb（簡(jiǎn)單模板）。延伸速度為2min/kb（70-75℃，簡(jiǎn)單模板可達(dá)20s/kb）。該酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。
產(chǎn)品組成
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Component |
P2021 |
P2022 |
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2× Pfu Mix |
1 ml |
1 ml× 5 |
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超純水 |
1 ml |
1 ml× 5 |
本產(chǎn)品分含體系中包含溴酚藍(lán)、不含溴酚藍(lán)兩類。體系中包含溴酚藍(lán)的產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可直接電泳檢測(cè)。這兩類產(chǎn)品的擴(kuò)增性能無差異。如無特別說明提供體系中包含溴酚藍(lán)的包裝。
保存條件
-20℃保存2年。
質(zhì)量控制
純度檢測(cè)：經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能檢測(cè)：PCR方法檢測(cè)無宿主殘余DNA，能有效擴(kuò)增人基因組中的單拷貝基因。
應(yīng)用舉例
1.?配制反應(yīng)體系
請(qǐng)于冰上配置反應(yīng)體系，體系大小與組分用量與添加順序可調(diào)整：
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Ordinal |
Component |
Volume (50 μl reaction volume) |
Final ? concentration (50 μl reaction volume) |
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1 |
2× Pfu Mix |
25 ? μl |
1× |
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2 |
upstream ? primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 ? μM |
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3 |
downstream ? primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 ? μM |
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4 |
template ? DNA[2] |
1-4 ? μl |
<1μg |
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5 |
超純水[3] |
To ? 50 μl |
- |
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optional |
MgCl2(MgSO4)/PCR ? Enhancer[4] |
Variable |
- |
[1]?引物終濃度建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。
[2]?不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建議用量如下表（50 μl反應(yīng)體系）。
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Template |
人類基因組DNA |
λDNA |
大腸桿菌基因組DNA |
質(zhì)粒DNA |
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Dosage |
0.1μg-1μg |
0.5ng-5ng |
10ng-100ng |
0.1ng-10ng |
[3]?可單獨(dú)訂購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。
[4]?可單獨(dú)訂購25mM MgCl2（Cat. #：P9031）和PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。
2.?設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)
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Stage ? |
Temperature |
Time |
Number ? of Cycles |
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Initial ? Denaturation |
94℃ |
3 ? min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 ? sec |
25-35 ? |
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Annealing |
55-68℃[1] |
30 ? sec |
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Extension |
72℃ |
Variable[2] |
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Final ? Extension |
72℃ |
5-10 ? min |
1 |
[1]?退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值較低的引物來設(shè)。
[2]?延伸時(shí)間按2min/kb來設(shè)最佳（簡(jiǎn)單模板可達(dá)20s/kb）。
3.?分析結(jié)果
反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設(shè)備觀察目的條帶的擴(kuò)增情況。如有需要，可進(jìn)行割膠回收。
無產(chǎn)物或產(chǎn)物量少的改進(jìn)措施有：1調(diào)整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴(kuò)增的成分，需要高倍稀釋（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl2（Cat. #：P9031）等可提高產(chǎn)量。
操作注意事項(xiàng)
1?室溫下Pfu DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴(kuò)增，請(qǐng)于冰上配置反應(yīng)體系，并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。
2?Pfu DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物只有平末端，可直接用于平末端連接。如要進(jìn)行TA克隆，請(qǐng)先進(jìn)行加A反應(yīng)，以提高克隆效率。（加A反應(yīng)：參考如下體系，72℃，15-30min）
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PCR（純化）產(chǎn)物 |
1-7 ? μl |
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10× ? Taq Buffer（Mg2+?Plus） |
1 ? μl |
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dATP ? |
0.2 ? mM |
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Taq ? DNA聚合酶 |
5U |
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超純水 |
To ? 10 μl |
3?堿基出錯(cuò)率是指在每個(gè)堿基合成過程中所摻入的錯(cuò)誤核苷酸數(shù)目。Pfu DNA聚合酶的堿基錯(cuò)誤率為1×10-6。
4?dUTP、dITP和含有這些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR擴(kuò)增。因?yàn)樵撁概c含有尿嘧啶和次黃嘌呤的DNA模板結(jié)合后會(huì)中止DNA聚合反應(yīng)。
引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)
引物長(zhǎng)度一般在15-30個(gè)堿基之間；上下游引物3’末端避免互補(bǔ)，避免出現(xiàn)3個(gè)以上重復(fù)的G或C，或出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量盡量接近；Tm值控制在55-65℃之間，且上下游引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點(diǎn)、修飾等）是非模板匹配序列，不參與Tm值計(jì)算。
相關(guān)產(chǎn)品
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名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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PCR Mix |
P2011/P2012/P2013/P2014/P2015 |
1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
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Power Green qPCR Mix |
P2101/P2102/P2103/P2104/P2105 |
1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
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1kb ladder |
M1181/M1182 |
50次/250次 |
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DSTM5000 |
M1111/M1112 |
60次/300次 |
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高純度質(zhì)粒小提試劑盒 |
N1011/N1012/N1013 |
50次/100次/200次 |
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通用RNA提取試劑盒 |
R1051 |
50次 |
|
基因組DNA快速提取試劑盒 |
N1111/N1112 |
50次/100次 |
|
DNA凝膠回收試劑盒 |
N1071/N1072/N1073 |
50次/100次/200次 |
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RT-PCR Kit |
R1011/R1012 |
20次/100次 |
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